聚焦CAR-T① | 肿瘤免疫治疗新贵


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编者注:

通过CAR-T治疗使用患者的自身免疫细胞杀死肿瘤细胞是近年来最流行的癌症治疗方法之一。 2017年,美国FDA批准推出两款CAR-T产品,开启了CAR-T疗法的新纪元。从那时起,CAR-T疗法的临床试验数量显着增加。

进行CAR-T治疗研究为特定患者群体带来了新的治疗希望,对人类克服重大疾病具有重要意义。那么,CAR-T疗法到底是什么?癌症治疗的独特优势有哪些,如放疗,化疗和靶向药物治疗? CAR-T疗法有哪些局限性和研究方向?目前的全球研发模式是什么? “专注于CAR-T”将与每个人深入解释这些问题,敬请期待!

免疫疗法是当前癌症治疗领域中最有希望的发展之一。随着免疫学检查点抑制剂如PD-(L)1的应用范围的增加,CAR-T治疗研究继续显示出新的进展。 CAR-T疗法不仅用于复发,还用作与传统药物不同的“活体药物”。难治性肿瘤患者已经证明具有突破性疗效,其生产系统和使用场景也与普通药物不同。鉴于生物技术的快速发展,预计CAR-T疗法将带来更多惊喜。

什么是CAR-T疗法?

CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)疗法是指通过遗传修饰技术将具有特异性抗原识别结构域和T细胞活化信号的遗传物质转移到T细胞中,从而使T细胞直接与特定抗原结合活化。肿瘤细胞的表面。 T细胞活化后,通过释放穿孔素,颗粒酶B等直接杀死肿瘤细胞;另一方面,通过释放细胞因子,招募人免疫细胞杀死肿瘤细胞以达到治疗肿瘤的目的。同时,可以形成免疫记忆T细胞以获得特定的长期抗肿瘤机制。

典型的CAR-T处理过程分为五个主要步骤:

从癌症患者外周血中分离,分离和纯化自身T细胞;

在T细胞活化后,修饰基因工程改造了特异性识别肿瘤细胞进入T细胞的CAR结构;

扩增,体外培养,CAR-T细胞大规模扩增至所需治疗剂量,一般在数十亿至数百亿级(取决于患者体重和治疗周期);

返回患者,并在化疗预处理后将CAR-T细胞送回患者体内。

监测,观察效果并密切监测不良反应。整个过程持续约3周,其中细胞“分离 - 修?? - 扩增”需要约2周。

CAR-T的结构

CAR通常由细胞外抗原结合结构域(例如识别CD19的单链抗体序列scFv),铰链区(促进抗原受体与肿瘤抗原的结合),跨膜区(用于固定CAR)和一个T细胞。激活结构域(CD3ζ,其提供T细胞活化的第一信号)和一个或多个细胞内共刺激结构域(CD28/4-1BB,为T细胞活化提供第二信号)。 CAR的细胞外抗原结合结构域来自抗体的抗原结合基序,并且可以与由VH和VL序列构建的单链可变区连接,并且具有特异性识别特定肿瘤相关抗原的功能。 CAR识别肿瘤相关抗原,然后通过细胞内信号传导结构域激活T细胞,刺激T细胞增殖,发挥免疫作用,释放细胞因子,并溶解肿瘤细胞。

经过十多年的发展,CAR-T经历了四代结构,每一个结构都在细节上突破,使CAR-T在更精确,更有效和更可持续的方向发展。 T细胞的完全激活取决于通过细胞外抗原结合结构域与抗原结合而传递的第一信号,另一方面,共刺激分子受体与其配体和表面结合传递的第二信号。肿瘤细胞的这种共刺激配体通常不表达。第一代CAR设计结构相对简单,临床试验结果不理想。第二代CAR引入了共刺激结构域CD28或4-1BB,其显着改善了临床试验中CAR-T免疫活性的激活并增加了作用的持久性。第三代CAR含有两个共刺激结构域,一个用于CD28或4-1BB,另一个用于OX40,CD28或4-1BB。与第二代相比,三代CAR在一些临床前试验数据中表现出更强和更持久的活性,但也有报道称三代CAR可能导致T细胞刺激阈值降低,导致信号泄漏,并可能诱导细胞。因素释放过多。

由于肿瘤细胞的异质性,一些肿瘤细胞不具有可被T细胞特异性识别的抗原,并且不能被常规CAR-T细胞识别和清除。这个问题可以通过四代CAR-T技术将T细胞以外的免疫细胞募集到肿瘤所在的区域来解决。四代CAR-T细胞,也称为TRUCK T细胞,含有活化的T细胞核因子(NFAT)转录对应物,其允许CAR-T细胞在肿瘤区域分泌特定细胞因子(目前主要是IL-12)。从而改变肿瘤微环境,招募和激活其他免疫细胞进行免疫反应。目前,已经在包括神经母细胞瘤在内的实体瘤中临床测试了四代CAR-T疗法。

第二代CAR-T具有更多的临床数据支持,高稳定性和成熟技术,这是目前的主流技术。未来,随着新结构的临床推广和生产工艺的改进,第三代和第四代CAR-T产品的卓越功效值得期待。

靶向抗原CAR-T

CAR-T技术针对抗原而非单个肿瘤,因此目标的选择是CAR-T有效性和安全性的基础。 CAR-T靶向的肿瘤抗原可分为两类:一类是肿瘤特异性抗原,是最理想的抗原。靶抗原的特异性越高,CAR-T细胞可以靶向特定肿瘤细胞的特异性越高,并且它不作用于正常细胞,从而减少不良反应。然而,这种理想的抗原并不多。目前,存在表皮生长因子受体EFGRvIII和前列腺特异性膜抗原PSMA。另一种类型是肿瘤相关抗原,其在肿瘤细胞表面上过表达并且在正常组织中低表达。目前,大多数肿瘤抗原靶标被使用。

最成功的临床应用案例是CAR-T,其以CD19作为靶标构建,但其适应症仅限于B细胞相关的血液肿瘤,例如B系淋巴细胞白血病(急性,慢性)和非霍奇金。淋巴瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤,滤泡性淋巴瘤,套细胞淋巴瘤等)。

根据Cell Trials,截至2017年10月,大约50%的全球CAR-T临床试验针对CD19靶向抗原,一小部分(约6%)使用由CD19和另一种抗原组成的抗原组合。除CD19外,CAR-T在治疗血液肿瘤中还有许多其他抗原,其中BCMA,CD22和CD20更常见。 BCMA正成为CAR-T治疗的热门目标。

根据2018年中国癌症登记年度报告,中国发病率最高的十大癌症是实体瘤,占所有癌症的77%。然而,实体肿瘤靶点的发展是困难的,相关的研究和开发还有很长的路要走。目前,针对间皮素的CAR-T临床试验数量最多,磷脂酰肌醇3(GPC3)的靶标靶向治疗肝癌和唾液酸神经节苷脂2(GD2)靶标。用于治疗肠癌的CEA靶向神经母细胞瘤和CAR-T疗法的治疗也受到广泛关注。

CAR-T结构中抗体scFv的筛选

CAR通过抗体的scFv(单链可变区)识别肿瘤抗原,因此CAR-T的开发需要获得和筛选单克隆抗体。在筛选高亲和力单克隆抗体后,将相应的杂交瘤细胞冷冻保存并传代以形成稳定的细胞株,用于构建CAR结构中的scFv序列。

scFv由重链,轻链和它们之间的接头组成,因此可以随机组合不同的重链和轻链以构建人源化scFv组合抗体文库,其由表达量,稳定性和表达量表示。抗原。筛选亲和力等指标。高通量筛选主要通过噬菌体展示技术。该技术的最大优点是它直接将表达的抗体与其基因型相关联,然后使用抗原 - 抗体的特异性结合来选择目标抗体。通过噬菌体技术,可以有效地获得scFv的人源化片段,并且可以提高CAR-T的安全性和有效性。

scFv序列是CAR-T开发的核心技术。从华创证券的研究资料来看,筛选合适的scFv序列的时间成本和成本并不低。鼠源的成本是几十万元。需要数百万美元的来源。目前,许多科研机构使用的序列都是从文献中获得的,原则上只能用于科学研究。因此,如果您想制造创新的CAR-T并将其商业化,您需要科研机构或企业进行自主研发。

CAR-T转染载体及制备方法

为了在T细胞上实现CAR表达,有必要通过载体将CAR基因引入T细胞中。理想的载体应具有高基因转染效率,良好的稳定性,并且不会引起机体的免疫反应。目前有多种载体可用于制备CAR-T细胞产物,包括病毒载体转导(如γ-逆转录病毒载体或慢病毒载体)和非病毒载体(如转座子转染,mRNA电穿孔)。染色等虽然临床试验主要是通过病毒载体转导进行的,但是用非病毒载体转染的方法也是有利的。

慢病毒载体是目前使用最广泛的载体系统。病毒基因转移载体的主要优点是它们相对容易制造,生产并且能够将遗传物质稳定地整合到宿主基因组中。然而,病毒载体的致病性和插入诱变的可能性在人临床试验中具有显着的调节障碍,因此非病毒载体的开发是重要的。转座子和mRNA电穿孔技术是目前研究的两种类型的非病毒载体系统。转座子最终可能发展成多功能T细胞基因转移系统,但目前的DNA电穿孔方法通常会产生较差的细胞活力,临床应用需要扩增T细胞培养物以产生大量T细胞。 mRNA电穿孔被认为是目前最安全的T细胞基因转导方法,可以转导缓慢或缓慢增殖的T细胞,转导效率超过90%,设计相对简单,经济。通过瞬时mRNA转染产生的CAR-T细胞已经在临床上使用,然而,该方法需要几轮CAR-T细胞输注。在临床前模型中,通过mRNA电穿孔转导的靶向间皮素的CAR-T可引起播散性间皮瘤异种移植物的消退,然而,在输注49天后,一名患者发生过敏反应。

CAR-T细胞的制备需要一些仔细的处理步骤,并且在整个过程中需要质量监测测试。 CAR-T的GMP制备过程主要包括:T细胞收集和分离,T细胞活化和修饰,T细胞扩增,T细胞收获和再输注。生产过程通常需要5到10天,从收集到再输注需要2到4周(根据患者的临床状态和化疗预处理方案确定)。

CAR-T细胞的制造是一个非常复杂的过程。它难以制造,高成本已成为该行业发展的瓶颈。目前,Gilead和Novartis都采用集中生产模式,首先在医院中提取患者的T细胞,然后将细胞运送到制造中心,在制造中心基因工程T细胞,最后设计T细胞是运回医院返回病人。但是,无论使用何种制造模型,成功的CAR-T电池制造都依赖于端到端的工艺优化功能,包括工作流程简化,容量规划和生产可扩展性。新一代自动化,全封闭的制造工艺是未来的发展方向。市场上已经有一些解决方案,例如Boya Holdings旗下的CAR-TXpressTM,Meitian的CliniMACS ProdigyTM和GE的FlexFactoryTM。

中国医学报)

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